RNA işlenmesi: alternatif kesilip-birleştirme ve izoform analizi

Alan: Moleküler biyoloji · Düzey: İleri IBO

PremRNA'dan olgun ürüne

Ökaryotlarda RNA polimeraz II ile üretilen birçok pre-mRNA, 5′ uç kapağı, intronların çıkarılması ve 3′ ucun kesilip poliadenillenmesi gibi işlemler geçirir. Spliceozomdaki snRNP bileşenleri 5′ ve 3′ kesim bölgelerini ve dallanma noktasını tanır. Klasik majör intronların sınırları sıklıkla GU–AG düzenindedir; tüm intronlar aynı sınır dizilerine sahip değildir. Lariat oluşumu iki transesterifikasyon tepkimesi içerir. Alternatif kesilip-birleştirme, bir genin farklı exon birleşimleriyle farklı RNA izoformları üretmesine olanak verir; her izoformun mutlaka kararlı ve protein kodlayan bir ürün verdiği söylenemez.

Eğer bir exon uzunluğu üçe bölünmüyorsa o exonun atlanması okuma çerçevesini değiştirip erken dur kodonu oluşturabilir. Ancak hangi eksonun atlandığı, exonun fazı ve alternatif transkript düzeni hesaba katılmalıdır. Prematür dur kodonlu bazı RNA'lar nonsense-mediated decay (NMD) ile azaltılır. RNA-seq'de bir eksonun dizileme kapsamı tek başına splice seçiminin tam ölçüsü değildir; ilgili ekson–ekson birleşim okumaları ve ifade düzeyi de incelenmelidir.

PSI hesaplama

Basitleştirilmiş bir kaset ekson modeli için PSI (percent spliced in)≈içeren okuma/(içeren+atlayan okuma)×100 olarak tanımlansın; burada her iki izoform için okuma fırsatının karşılaştırılabilir olduğu varsayılır. Gerçek kaset ekson analizinde içeren izoformun iki birleşimi, atlayan izoformun bir birleşimi vardır. Örneğin içeren birleşimlerde 60 ve 60, atlayan birleşimde 40 okuma varsa, eşit etkin uzunluklar altında birleşim başına içeren desteği (60+60)/2=60 alınır ve PSI=%60 elde edilir. Ham toplamı doğrudan kullanmak %75 ile fazla tahmin yapar. Kullanılan yöntem etkin uzunlukları ve örnekler arası değişkenliği hesaba katmalıdır. İleri okuma · rMATS ile alternatif kesilip-birleştirme

Kontrolde PSI=%80; tedavide %30. Değişim −50 yüzde puanıdır, 'ifade %50 azaldı' denemez; genin toplam mRNA bolluğu verilmemiştir. Aynı genin transkripsiyon hızı değişmeden izoform oranı değişebilir.

Çözümlü IBO tipi soru

Bir kaset eksonun uzunluğu 91 nt'dir. Kodlama bölgesinde çerçeveyi değiştirmeden atlanması beklenir mi?

A) Evet, 91 üçe bölünür B) Hayır, 91 mod 3 = 1 C) Yalnız protein terminaldeyse kesin evet D) RNA işlenmesini etkilemez E) Her zaman protein artar.

Yanıt B. Basit tam kodlayan ekson atlama modelinde 91 nt'lik kayıp üçe bölünmediğinden aşağı akış çerçevesi değişir. Fakat başlangıç/son ekson, alternatif okuma çerçevesi ve NMD gibi ayrıntılar bireysel transkriptte ayrıca kontrol edilmelidir.

Kaynak yönlendirmesi: OpenStax Biology 2e, bölümler 15.4 ve 16.5.

İleri uygulama · Splicing ölçümünde birleşim okumalarının düzeltilmesi

Alternatif ekson analizinde 'ekson üzerindeki toplam okuma sayısı', yalnız genin bolluğundan da etkilenir. Bu nedenle izoformları ayırabilen ekson–ekson birleşim okumaları, transkript uzunluğu ve hizalama belirsizliği birlikte dikkate alınmalıdır. Düşük kapsamlı genlerde PSI uç değerlere savrulabilir. Bağımsız biyolojik tekrarlar, beta-binomial gibi aşırı dağılıma izin veren modeller ve RT-PCR doğrulaması güveni artırabilir. RNA izoformunun farklı okuma çerçevelerini ve nonsense-mediated decay olasılığını araştırmadan protein sonucu çıkarılmamalıdır.

İkinci analitik soru: Üç bağımsız örnekte PSI değerleri kontrol için %80, %78, %82; tedavi için %42, %40, %38 olsun. Grup ortalamaları %80 ve %40'tır; fark 40 yüzde puan. Üç değer birbirine yakın olsa da numune bağımsızlığı ve istatistiksel yöntem belirtilmeden biyolojik anlamlılık hakkında mutlak karar verilmez. PSI oranı ile toplam gen ifade düzeyi ayrı analiz edilir.