Alan: Moleküler biyoloji | Beceri: mRNA miktarı ile translasyon etkisini ayırmak
miRNA ve siRNA yolları
Hayvanlardaki yaygın miRNA yolunda Drosha–DGCR8 kompleksi öncül RNA’yı çekirdekte işler, Dicer ise sitoplazmada ikinci kesimi yapar. Bazı miRNA’lar bu yolun basamaklarından birini atlar. Örneğin Arabidopsis’te olgunlaşmanın başlıca kesimleri çekirdekte DCL1 tarafından yapılır. Argonaute içeren RISC kompleksine yüklenen kılavuz RNA, hedef mRNA ile baz eşleşmesi üzerinden etki eder. Hayvanlarda kısmi eşleşme translasyonun baskılanması ve mRNA destabilizasyonuyla sonuçlanabilir; yüksek tamamlayıcılık bazı Argonaute türlerinde doğrudan kesimi destekler. siRNA'lar çift iplikli RNA kökenli olabilir ve bazı sistemlerde hedef kesimini etkin biçimde yönlendirir. Ancak miRNA ve siRNA arasındaki ayrım yalnız uzunluğa bakılarak yapılamaz; köken, biyogenez ve hedefleme özellikleri de önemlidir.
Gen ifadesi ve protein miktarı farklı değişkenlerdir
Bir genin mRNA miktarı transkripsiyon ve RNA yıkımıyla; protein miktarı ise translasyon ve protein yıkımıyla belirlenir. mRNA sabitken protein azalması translasyon engellenmesi veya proteinin daha hızlı parçalanmasıyla uyumlu olabilir. mRNA azalırken proteinin sabit kalması da uzun protein yarı ömrüyle açıklanabilir. Bu nedenle RT-qPCR, Western blot/immünofloresan ve ribozom profillemesi farklı düzeyleri sorgular. Gen düzenlemesi yapan bir miRNA'nın hedefe doğrudan bağlandığını kanıtlamak için hedef 3′-UTR dizisini içeren raporlayıcı ve bağlanma bölgesi mutasyonu karşılaştırılabilir.
Deney kurulumu ve kontroller
Bir miRNA taklidi (mimic) ile protein seviyesi düşerse aynı hücrede transfeksiyon toksisitesi, hücre sayısı ve negatif kontrol RNA'sı sınanmalıdır. Raporlayıcı genin 3′-UTR bölgesinde tahmini bağlanma yeri bozulduğunda etkinin kaybolması, hedefe özgül etkiyi destekler. Ancak raporlayıcının kromozomal bağlamı doğal genle aynı değildir; endojen hedefte doğrulama gerekir. Ago pull-down/CLIP gibi yöntemler RNA-protein temasını gösterir; temasın fonksiyonel baskılama olduğunu tek başına ispatlamaz.
Nicel hesap
Kontrolde mRNA bağıl düzeyi 1,00; miRNA uygulamasında 0,80. Protein düzeyleri sırasıyla 1,00 ve 0,30. mRNA %20 azalırken protein %70 azalmıştır. Bu bulgu translasyon baskısı ile tutarlı olabilir ama protein kararlılığındaki değişimi dışlamaz. RT-qPCR’de referans genin kararlılığı kontrol edilir. 2−ΔΔCq yaklaşımı için hedef ve referans amplifikasyon verimlerinin benzer ve yaklaşık %100 olduğu doğrulanır. Verimler farklıysa verim düzeltmeli bir yaklaşım kullanılır. Bir miRNA çok sayıda hedefi düzenlediğinden yalnız bir hedefle biyolojik fenotipi açıklamak aşırı yorum olabilir.
IBO problemi ve çözüm
Bir miRNA uygulaması sonrası hedef mRNA %80, hedef protein %30 düzeyinde kalıyor. Hangi deney translasyon baskısı ile protein yıkımı artışını ayırmada en anlamlıdır? A) Hücre rengini gözlemek B) Proteinin yarı ömrünü pulse–chase veya uygun protein sentezi durdurma deneyinde belirlemek C) Yalnız DNA miktarını ölçmek D) RNA'yı boyamamak E) Yalnız başlangıç protein miktarını tekrar ölçmek.
Yanıt B. Protein yıkım hızı değişmezken yeni sentez azalıyorsa translasyon baskısı desteklenir. Sentez engelleyicinin kendi yan etkileri nedeniyle ortogonal yöntemler tercih edilebilir.
Ayrıntılı okuma · Bartel · Hayvanlarda mikroRNA işlenmesi · Arabidopsis’te DCL1 ve HYL1 · MIQE 2.0 · qPCR ölçüm ve raporlama kılavuzu
Kaynak çerçevesi: Alberts, Molecular Biology of the Cell; RNA silencing ve Argonaute biyolojisi.
Bu notta yer alan veriler eğitim amacıyla kurgulanmıştır. Resmî IBO materyali değildir; bilimsel kaynak ve görsel açıklamaları için kaynaklar sayfasına bakınız.